Actividad de unión de la proteína adhesiva relacionada con trombospondina de Plasmodium vivax (PvTRAP) a células HepG2

Arévalo Pinzón, Gabriela | 2019-12

La invasion de esporozoitos de Plasmodium spp a hepatocitos humanos representa el primer paso para que se establezca la invasion en el humano, esto ocurre mediante la interacción de proteínas de la superficie del esporozoito y receptores en la superficie del hepatocito. La proteína anónima relacionada con trombospondina de Plasmodium vivax (PvTRAP) es un polipéptido presente en la superficie de esporozoítos, del cual en otras especies de Plasmodium se ha investigado su participación en el proceso de invasión al hepatocito. Esta proteína es conservada en varias especies del género Plasmodium caracterizándose por la presencia de un dominio de repetición de trombospondina tipo I (TSR) y un dominio A similar al Factor von Willebrand (vW). En el presente estudio se amplificaron dos fragmentos del gen pvtrap que codifican para el ectodominio de la proteína PvTRAP y los dominios TSR-vW. Cada producto fue clonado en el vector pFastBac-HT-C y secuenciado mediante la técnica de Sanger, obteniendo por primera vez la secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la proteína PvTRAP derivada de la cepa VCG-1. Los clonos recombinantes confirmados fueron utilizados para la obtención de baculovirus recombinantes en células de insecto Sf9. Una alta concentración de stock viral fue utilizada para la expresión de los dos fragmentos recombinantes: PvTRAP y PvTRAP-vW-TSR. El ectodominio PvTRAP se purificó mediante cromatografía de afinidad, se dializó exhaustivamente frente a PBS y se cuantificó. Mediante ensayos de citometría de flujo se encontró que la proteína PvTRAP se unió a la línea celular hepática ATCC HB-8065. Futuros estudios son necesarios para evaluar las regiones mínimas de interacción con el fragmento PvTRAP-vW-TSR. Los resultados de este estudio destacan la capacidad de PvTRAP para interactuar con la célula blanco de P. vivax y pone en evidencia el potencial de esta polipéptido en P. vivax como ha sido mostrado para P. falciparum.

Antigenicidad de la proteina ?celtos? de plasmodium vivax para su evaluacion como posible candidata a vacuna

Vargas Otalora , Sandra Viviana | 2017

Aproximacion a la diversidad alelica de los marcadores de resistencia a antimalaricos pvmdr1 y pvdhfr de plasmodium vivax en la Amazonia colombiana

Ortega Ortegon, Anggie Lizeth | 2017

Caracterizacion de la diversidad genetica del locus celtos de plasmodium vivax

Reyes Guarin , Leidy Paola | 2017

Clonación y expresión de dos fragmentos de la proteína Spatr de plasmodium vivax en el sistema Escherichia coli

Hernández Rojas, Edith del Carmen | 2020-03-20

La malaria causada por la especie Plasmodium vivax, es una enfermedad de alto impacto en salud pública alrededor del mundo, se reporta que el 53% de los casos de malaria por esta especie se concentran en el Sudeste Asiático, el 47% en la India y en países de América latina representa una amenaza permanente, siendo la especie predominante con alrededor del 75% de los casos de paludismo. P. vivax ha demostrado un interés de investigación debido a su importancia epidemiológica, a pesar de esto los estudios respecto a las interacciones moleculares en el proceso de invasión se han visto retrasados por su difícil propagación in vitro debido a la preferencia del parásito por invadir reticulocitos, como consecuencia de lo anterior el conocimiento sobre las moléculas envueltas en el proceso de invasión, es escaso. En este estudio se expresaron y analizaron estructuralmente dos fragmentos de la proteína PvSPATR, el fragmento 1 con un tamaño 333 de pb y el fragmento 2 con un tamaño de 429 pb a través del uso de técnicas moleculares, como PCR y, técnicas inmersas en la obtención de las proteínas recombinantes. Esta proteína ha sido reportada en P. falciparum como importante para la unión del esporozoito a los hepatocitos y, como proteína multiestadío, lo que sugiere continuar con ensayos de unión y creación de péptidos específicos que determinen la importancia de este antígeno a nivel funcional in vitro y permita así una aproximación de su función in vivo.

Comparacion mediante la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) y la gota gruesa como tecnicas para la deteccion y tipificacion de la malaria en la Amazonia Colombiana

Paez Hernandez, Astrid Carolina | 2017

Determinación de la unión a reticulocitos humanos de los fragmentos conservado y variable de la proteína TRAMP de Plasmodium Vivax.

Hernández Rojas, Edith del Carmen | 2020

Plasmodium sp. es el causante de malaria una de las enfermedades más antiguas, el cual contiene todo un sistema de invasión mediada por proteínas secretadas por diferentes organelos presentes en su estructura, estas proteínas aunque bien caracterizadas y estudiadas, en gran proporción las de especies que concurren en un cuadro clínico en humanos no están cubiertas por procesos de investigación en un 100% por lo que es necesario y la obtención de esas proteínas faltantes de manera in vitro bajo sistemas de expresión y ese es el propósito de este trabajo, pues es un aporte continuo de gran amplitud investigativa que otorga resultados significativos para la comprensión de la misma y a su vez propone un adelanto en procesos de mitigación en la especie Plasmodium vivax En este estudio se obtuvo de manera recombinante la proteína PvTRAMP fragmentada en una porción conservada y una variable de Plasmodium vivax empleando un sistema de expresión procariota Escherichia coli, con un posterior enriquecimiento de reticulocitos humanos a los cuales tiene tropismo y con estos por primera vez fueron realizados ensayos de unión que esclarecen la actividad de dicha proteína y favorecen comprensión de su papel en la invasión, ya que es una proteína que se encuentra en el merozoito lo cual nos indica que puede tener un papel revelador en la invasión a células diana. Se determinó que en efecto los fragmentos variable y conservado de la proteína PvTRAMP poseen capacidad de unión tanto a reticulocitos humanos como a glóbulos rojos maduros, dejando abierta una línea de investigación útil en la propuesta de dicha proteína como componente candidato a la vacuna contra el cuadro malárico causado por Plasmodium vivax

Evaluacion de la interaccion entre la proteina del antigeno Apical de membrana 1 de plasmodium vivax (pvama1) y los Receptores de reticulocitos humanos.

Velandia Cuellar, Andrea | 2015

Evaluación de la antigenicidad de péptidos derivados de la proteína pv12 de Plasmodium Vivax en muestras obtenidas de individuos de zonas endémicas de Colombia

Lopez santana, Carolina | 2018-05-31

La malaria es una enfermedad que afecta poblaciones en todo el mundo, y se presenta en áreas geográficamente adecuadas para la supervivencia del mosquito transmisor del género Anopheles. Este vector es el encargado de trasmitir el parasito intracelular del género Plasmodium, el cual presenta 5 especies clínicamente relevantes en el ser humano. Plasmodium vivax es la segunda especie más relevante, ya que presenta mayor incidencia y mortalidad a nivel mundial después de Plasmodium falciparum. Cabe resaltar que esta especie por sus características fisiológicas, no dispone de un cultivo continuo in vitro, por lo cual los avances en investigaciones son muy limitados. En este estudio se evalúo la antigenicidad de péptidos identificados como epitopes T, derivados de la proteína Pv12 de P. vivax en pacientes tipificados para HLADRB1*, mediante ensayos de linfoproliferación y cuantificación de citoquinas, además se evaluó la reactividad de epitopes B por medio de inmunoensayos. Los resultados permitieron evidenciar la respuesta antigenica de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de los individuos que habían cursado la enfermedad, esta estimulación se evidencio en mayor medida por los péptidos 39113 y 39117, presentando una visible linfoproliferacion y altos niveles de IL-6 e IL-10, encaminando asi un perfil inmune por la vía Th2, por malaria causada por P.vivax, por otra parte, no se identifico diferencias significativas con relación al reconocimiento de epitopes B.

Evaluación de la unión de la proteína secretada con dominio de repetición de trombospondina alterado (SPATR) de Plasmodium vivax a células hospederas.

Sánchez Mora, Ruth Mélida | 2021-09

La malaria en Colombia representa una enfermedad importante a nivel nacional debido a que nuestro país presenta las condiciones climáticas, geográficas y epidemiológicas aptas para la transmisión de esta enfermedad. Particularmente la especie Plasmodium vivax es una de las más prevalentes en nuestro territorio lo que refleja entonces, la necesidad de implementar estudios sobre la biología básica de este parásito que involucren la búsqueda de blancos terapéuticos de acción. Durante el complejo ciclo de invasión de Plasmodium, se ha observado que el parásito expresa distintos antígenos para interactuar con la célula hospedera, entre estas, la proteína secretada con dominio de repetición de trombospondina alterado (SPATR). Esta proteína se reconoce como una proteína multietapa ya que en especies diferentes a Plasmodium vivax se ha evidenciado la presencia de esta en estadio sexual y asexual, además de tener capacidad para inducir una respuesta de anticuerpos. Sin embargo, en P. vivax no se ha establecido si esta proteína puede estar participando en eventos de adhesión a la célula hospedera (hepatocitos y reticulocitos), lo que supone un gran reto para la investigación de esta proteína y su importancia en el proceso de invasión. En este trabajo se evaluó la unión de la proteína SPATR a células hepáticas y reticulocitos humanos. Para cumplir con el objetivo se utilizó plásmido que contenía la secuencia de nucleótidos del gen spatr para transformar bacterias E. coli y obtener en estas células la proteína PvSPATR recombinante. La proteína fue purificada mediante procesos cromatográficos y fue incubada con células hospederas. Los resultados mostraron que, a pesar de la importancia de esta proteína en otras especies parasitarias, la proteína PvSPATR no interactúa directamente con reticulocitos y hepatocitos humanos. Esto sugiere que SPATR en P. vivax puede estar cumpliendo otras funciones durante el proceso de invasión del parásito que no involucran interacciones del tipo receptor-ligando o puede estar mediando interacciones macromoleculares con la membrana de la célula hospedera indirectamente. Esta investigación muestra que si bien, los parásitos de la malaria que infectan al humano comparten varias proteínas durante su ciclo de invasión, cada una de ellas puede estar cumpliendo distintas funciones como es el caso de la proteína PvSPATR.

Expresion de fragmentos de la proteina de union a Duffy-1 y la proteina de union a Reticulocitos-1 de Plasmodium vivax y su uso como control en ensayos de interaccion con reticulocitos humanos

Gomez Munoz, Laura Alejandra | 2016

Inmunodeteccion del antigeno de micronemas anclado a gpi (gama) en el lisado de parasitos de la cepa vcg-1 de plasmodium vivax.

Ortiz Suarez, Heidy Daniela | 2015

Interacción de la proteína Tlp de Plasmodium Vivax con células Hepáticas y Epiteliales como mediadora del atravesamiento celular.

Arévalo Pinzón, Gabriela | 2021-05-28

La malaria causada por Plasmodium vivax continúa siendo un problema de salud pública en el mundo y desafortunadamente la resistencia de este parásito ante las opciones terapéuticas enfatizan la necesidad de profundizar en el estudio biológico de P. vivax con el fin de desarrollar nuevas alternativas que ayuden a mitigar la situación. Se ha descrito, que la familia de proteínas relacionadas con la trombospondina (TRAP) están involucradas en procesos como la motilidad del parásito y la invasión a las células hospederas. Un miembro de esta familia es la proteína similar a TRAP (TLP, del inglés, TRAP- like protein) presente en las diferentes especies del género Plasmodium, lo cual sugiere que TLP cumple una función importante para el desarrollo del parásito durante una o más etapas del ciclo de vida. En especies como P. falciparum se ha encontrado que está proteína está involucrada en un proceso denominado atravesamiento celular el cual corresponde a la interacción con un amplio número de células epiteliales y hepáticas hasta acceder al hepatocito. Teniendo en cuenta la relevancia funcional de esta proteína, este proyecto de investigación se enfocó en evaluar la interacción que tiene la proteína TLP de P. vivax con estas células durante el desplazamiento del esporozoíto. Los resultados muestran que la proteína recombinante PvTLP interactúa con las células HepG2 y HeLa y tres péptidos localizados en el dominio vWA fueron capaces de inhibir la unión de la proteína a las HepG2, donde el péptido 42433 presentó una unión específica superior al 1%.

Mutagenesis sitio-dirigida de los residuos 128 y 179 del antigeno apical de membrana 1 de plasmodium vivax: diseno y expresion de proteinas mutantes

Pulido Quevedo, Fredy Alexander | 2015

Primera aproximacion a la diversidad alelica de los genes que codifican el transportador de resistencia a cloroquina y la dihidropteroato sintasa de plasmodium vivax en la Amazonia colombiana

Orduz Duran, Maria Fernanda | 2017

Producción de bácmidos recombinantes del ectodominio de la proteína del circumsporozoito (EcCSP) y de la región ll de la proteína de Unión al Duffy (DBP-RII) de Plasmodium vivax.

Sánchez, Ruth Mélida | 2021-11

Plasmodium vivax es una de las especies más ampliamente distribuidas a nivel mundial, pero desafortunadamente no se ha podido investigar a profundidad los mecanismos de invasión debido a la incapacidad de realizar un cultivo continuo in vitro. Por lo tanto, es necesario encontrar diferentes alternativas para estudiar las interacciones del parásito con las células hospederas. Dentro de las estrategias abordadas por distintos investigadores, se encuentra la evaluación de las interacciones receptor-ligando mediante el uso de proteínas recombinantes derivadas de P. vivax y células hospederas. A partir de estos experimentos se han elucidado algunas interacciones claves en el proceso de invasión de P. vivax. Teniendo en cuenta que esta es una estrategia adecuada para medir las interacciones entre el patógeno y la célula hospedera, es necesario la producción de los controles de interacción positivos que puedan usarse para validar las nuevas interacciones de P. vivax. Motivo por el cual, este trabajo se enfocó en la producción de bácmidos recombinantes que contienen la región que codifica para el ectodominio de la proteína circumsporozoito (CSP) y de la región II de la proteína de unión a Duffy (DBP). Para esto, se amplificaron las dos regiones de cada proteína y se clonaron en el vector PfastBac-HTC obteniendo plásmidos recombinantes llamados pFastBacHT-C-EcPvCSP y pFastBacHT-C-PvDBP-RII, que se utilizaron para transformar células DH10Bac que contenían el DNA viral generando bácmidos recombinantes bMON14272-PvDBP-RII y bMON14272-EcPvCSP con una concentración para de 158,9 ng/μl y 430 ng/μl respectivamente, los cuales fueron aislados y serán utilizados en posteriores estudios para transfectar células Sf9, encargadas de la producción de las partículas virales y de la producción de las proteínas recombinantes. Estas proteínas serán utilizadas como controles para evaluar interacciones proteína-proteína de diferentes antígenos de P. vivax en busca de métodos de control contra esta especie parasitaria.